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2025年4月22日，國際頂級學術期刊Nature以“加速預覽（Accelerated Article Preview）”的形式在線發表了中國科學院上海藥物研究所柳紅團隊與上海科技大學、清華大學、中國科學院武漢病毒研究所和重慶醫科大學等多家單位合作的題為“Substrate recognition and cleavage mechanism of the monkeypox protease,Core protease”的最新研究成果。該工作在國際上首次闡明了猴痘病毒核心蛋白酶（Core protease,Core^Pro）三維結構，揭示了核心蛋白酶底物識別與催化的分子機制，通過基于結構的藥物設計策略發現了具有高效酶抑制活性和廣譜抗正痘病毒活性（猴痘病毒、痘苗病毒）的先導化合物，并闡明其微觀作用機制。該系統性工作證實了正痘病毒的核心蛋白酶是一個全新的廣譜抗病毒藥物靶標，為靶向核心蛋白酶開發廣譜高效抗正痘病毒藥物提供了堅實的結構基礎和良好的先導化合物。

猴痘病毒屬于正痘病毒屬（orthopoxvirus genus），該屬還包含3種已知的人畜共患病毒，分別是天花病毒（VARV）、痘苗病毒（VACV）和牛痘病毒（CPXV）。歷史上，人類與天花病毒斗爭了近千年，曾有數億人因天花病毒感染死亡。自1970年剛果民主共和國報道首例猴痘病例以來，猴痘病毒主要流行于非洲中部和西部，在非洲以外地區很少發現。2022年5月，猴痘病毒擴散傳播至英國，并迅速席卷全球，截至2025年2月28日，全球131個國家和地區共報道了13.4萬例猴痘病例，死亡291例。猴痘疫情分別于2022年7月23日和2024年8月15日兩次被WHO宣布為國際關注的突發公共衛生事件（PHEIC）。目前尚無具有明確療效的抗猴痘病毒藥物，因此發現和確證抗猴痘病毒新靶標，開發結構新穎、低毒高效且具有自主知識產權的抗猴痘病毒藥物具有重大意義，既可用于應對當前猴痘疫情，又可作為國家儲備藥以應對未來正痘病毒暴發危機。

正痘病毒是一類包膜的雙鏈DNA病毒，復制過程中會編碼一種高度保守的核心蛋白酶（在痘苗病毒和猴痘病毒中稱為I7L，在天花病毒中稱為K7L），核心蛋白酶通過水解核心蛋白前體驅動感染性成熟顆粒（IMV）的形成，在正痘病毒生命周期中發揮了重要作用，因此闡明其三維結構和底物識別機制，并基于此開展先導化合物的發現研究具有重要意義。

研究團隊成功解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維結構（圖1）。核心蛋白酶為二聚體，每個單體可分為N端結構域NTD、催化結構域CD和C端結構域CTD。活性中心位于催化結構域，包含一個特征的催化三聯體Cys328-His241-Asp258。研究團隊通過高通量篩選策略發現泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d具有潛在的核心蛋白酶抑制效果和抗猴痘病毒活性，但活性較弱。猴痘病毒核心蛋白酶與E64d的復合物結構解析發現其與活性中心附近一個非催化Cys237殘基發生共價結合，未能完全占據底物結合口袋。

圖1 猴痘病毒核心蛋白酶的整體結構、催化結構域特征及二聚化模式

為了開發更強效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制劑，研究團隊開展了猴痘病毒核心蛋白酶底物識別和催化機制的研究。基于核心蛋白酶天然底物P25K序列，利用醛基替換切割斷裂的酰胺鍵設計了底物類似物I-G18，期望能夠與催化中心Cys328共價結合，模擬催化中間體的結構特征。研究團隊通過冷凍電鏡技術，成功解析了CorePro-I-G18復合物結構（圖2）。與apo結構相比，在底物的誘導下，核心蛋白酶活性中心會發生一系列構象變化，暴露出催化活性中心，完成底物的水解。S1和S2口袋形成了特征性的狹長空腔，僅可容納Gly（P1位）和Ala（P2位）等側鏈尺寸較小的氨基酸殘基，合理解釋了正痘病毒核心蛋白酶Ala-Gly序列識別專一性。

圖2 猴痘病毒核心蛋白酶的底物識別機制

以核心蛋白酶的底物識別機制為基礎，研究團隊利用基于結構的藥物設計策略設計合成了擬肽類抑制劑A1~A6，引入P1~P5片段分別占據核心蛋白酶S1~S5底物結合口袋，同時在P1位置連接親電彈頭warhead與催化中心Cys328殘基共價結合（圖3）。活性測試發現A2~A6具有高效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性（IC₅₀為44.9～100.3 nM），其中化合物A3活性最優，IC₅₀達到44.9 nM，較底物衍生的九肽醛I-G18提高7倍（I-G18的IC₅₀為314 nM）。為了闡明酶抑制活性的差異，研究團隊解析了A1、A3和A4與核心蛋白酶的復合物結構，結果顯示三個化合物均可與催化中心的Cys328殘基共價結合，同時能夠較好地占據底物結合口袋，其中A3的P4片段F原子能夠與Asp194殘基形成額外氫鍵相互作用，合理揭示了A3酶抑制活性更優的原因。抗病毒活性測試發現，化合物A3~A6具有較強的抗猴痘病毒活性（EC₅₀為1.98～7.31 μM）和抗痘苗病毒活性（EC₅₀為1.39～3.66 μM），具有廣譜性；同時表現出良好的安全性，CC₅₀均大于200 μM。相較于九肽醛I-G18，擬肽類化合物的抗病毒活性顯著提高（I-G18在50 μM濃度下未顯示出抗病毒活性）。研究結果表明，A3~A6是良好的先導化合物，有望通過進一步成藥性結構優化開發出廣譜抗正痘病毒藥物。?

圖3 核心蛋白酶抑制劑的設計發現與作用模式研究

（^a猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性；^b抗痘苗病毒活性；^c抗猴痘病毒活性）

柳紅課題組長期致力于抗病毒藥物的研發，其中針對新冠病毒開發的主蛋白酶抑制劑FB2001已進入臨床II/III期研究，相關工作發表于國際頂級期刊Science（封面文章）和病毒學領域著名期刊Antivir. Res.；針對HIV開發的CCR5拮抗劑塞拉維諾已順利完成臨床I期，相關工作發表于藥物化學領域頂級期刊J. Med. Chem.（封面文章）。此外，針對冠狀病毒、腸道病毒、流感病毒、諾如病毒、腺病毒等病原體開展了創新藥物的發現研究，多個先導化合物表現出高效的體內外抗病毒活性和良好的成藥性，相關工作已發表于Signal Transduct. Target Ther.、J. Med. Chem.、Chem. Commun.、Eur. J. Med. Chem.、Viruses等國際學術期刊。

該研究工作獲得了教育部學科突破先導項目、國家自然科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項、上海市重大傳染病和生物安全研究院、上海尚思自然科學研究院等項目的資助。上海科技大學生物電鏡平臺、上海同步輻射光源、國家蛋白質科學研究（上海）設施等平臺為本工作提供了技術支持。

全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-09014-x