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2025年6月25日，中國科學院分子植物科學卓越創新中心巫永睿研究團隊聯合張余研究團隊以及上海師范大學王文琴研究團隊在Nature Plants上發表了題為 “PEN1 catalyses RNA primer removal during plastid DNA replication in maize”的研究論文。科研人員經過八年不懈探索，最終揭示了植物質體DNA（ptDNA）復制體中RNA引物切除的核心核酸酶組分plastid-localized and Mn²⁺-dependent 5’-3’exonuclease 1 (PEN1)。長期以來，植物ptDNA復制中負責RNA引物切除的核酸酶一直未被鑒定到，而PEN1的發現填補了這一關鍵領域的空缺，完善了ptDNA復制理論。

DNA復制是生命科學的核心基礎問題之一。雙鏈DNA解旋后引物酶在模板鏈上合成RNA引物。前導鏈僅需合成一個RNA引物即可由高持續合成能力的DNA聚合酶實現連續延伸，而滯后鏈則需合成多個RNA引物，通過不連續的岡崎片段合成方式完成復制。DNA復制后，RNA引物由核酸酶負責切除，從而保證基因組的完整性。在原核生物中，如大腸桿菌，DNA聚合酶III是主要負責DNA復制的聚合酶，而DNA聚合酶I是負責切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I除了具有聚合酶活性外，還具5′-3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA鏈時，同步利用其外切酶活性切除RNA引物，這一過程稱為缺口翻譯（Nick translation）。

在內共生過程中，光合藍細菌被非光合真核生物整合共生，最終演變成了質體。質體根據其形態和功能的差異，主要分為葉綠體、淀粉體和有色體等，它們分別在光合作用、淀粉合成和代謝調控中扮演著關鍵角色。盡管功能各異，但所有質體都起源于共同的前體（前質體），并具有相同的遺傳物質。質體是半自主的細胞器，Pol1A和1B負責ptDNA的復制；然而，其缺乏DNA聚合酶I類似的5’-3’外切酶結構域。因此，負責ptDNA復制過程RNA引物切除的核酸酶的身份，長期以來一直是一個未解之謎。擬南芥中，AtRNH1C可能參與RNA引物切除；然而，這一過程并非完全高效，AtRNH1C切割后會在RNA-DNA連接處殘留1-3個核糖核苷酸，從而抑制DNA片段的連接。因此，研究人員推測還需要其他尚未被鑒定的質體定位的核酸酶來完全切除RNA引物并允許DNA片段連接，從而確保ptDNA復制的成功完成。

2017年，剛進實驗室的研究生黃興和導師巫永睿研究員在山東泰安的夏季試驗田里，從甲基磺酸乙酯（EMS）誘變群體分離到pen1突變體。與之前報道的在世代間表現出穩定遺傳表型的籽粒突變體不同，pen1胚乳發育和灌漿存在缺陷，且隨著世代繁衍加劇的特征。值得注意的是，pen1/+自交分離的純合突變體（pen1^F2）的胚乳質體發育僅伴隨輕微缺陷，而pen1^F2繼續自交后代（pen1^F3）的胚乳前質體均不能正常分化，胚乳表現為完全空殼。

研究人員成功分離了Pen1位點，發現其編碼質體特異定位的5’-3’外切酶。PEN1與ptDNA復制體的其他成分（Pol1A/1B和連接酶LIG1）共定位于葉綠體擬核。研究表明，PEN1能高效切割RNA引物切除過程中間體，并完全移除RNA-DNA連接處的核糖核苷酸，從而促進了LIG1的連接。研究人員成功在體外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1介導的質體RNA引物去除過程，證實PEN1的確參與了ptDNA復制過程RNA引物移除。

此外，研究人員還解析了PEN1-雙鏈DNA二元復合物的晶體結構。在PEN1的催化中心，被切割DNA鏈的第1個核苷酸的5’單磷酸基團與活性中心的Mg2+形成配位鍵、連接第2和第3個核苷酸的磷酸二酯鍵同時與K250、R264、R283形成三個鹽橋，這使得被切割DNA鏈在活性中心的相對位置被固定，從而使PEN1精確切割1和第2個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，發揮其核酸外切酶活性。為了探究Pen1突變對ptDNA的影響，研究人員通過分離ptDNA和Detail-Seq發現Pen1功能缺失直接導致ptDNA的斷裂，且斷點主要積累在ptDNA正義鏈上。同時，研究人員還發現Pen1功能缺失抑制了ptDNA的復制和轉錄活性，從而影響了質體的正常發育和功能。

對質體遺傳和復制機制的系統性闡述，對于理解質體發育和推動植物遺傳工程至關重要。盡管已鑒定出越來越多參與ptDNA復制的因子，但負責移除RNA引物的特定組分一直不明確。本研究鑒定到的質體特異性的5’-3’外切酶PEN1能直接催化質體DNA復制過程中RNA引物的移除，并闡明了其結構基礎。這些發現為質體復制（尤其是RNA引物移除過程）提供了深刻的見解，助于推動作物改良的質體遺傳工程進展。

中國科學院分子植物科學卓越創新中心博士后黃興，博士生石國龍以及已畢業博士肖俏（現安徽農業大學博士后）為本研究論文的共同第一作者。四川農業大學黃永財教授，上海師范大學研究生馮嬌嬌等參與了該研究。中國科學院分子植物科學卓越創新中心巫永睿和張余研究員以及上海師范大學王文琴教授為通訊作者。清華大學生命科學學院植物生物學研究中心孫前文副教授和張衛峰博士在ptDNA損傷檢測提供了大量幫助。該研究工作得到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金重點和青A延續，中國科學院先導B，尚思探索學者和國家資助博士后B類等項目的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-025-02027-4

PEN1介導ptDNA復制RNA引物的移除

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